基于细胞质枯竭细胞的重组系统研究磷脂酶D的调控。
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Fensome-Green A, Cockcroft S
基于细胞质枯竭细胞的重组系统研究磷脂酶D的调控。
方法Mol Biol. 2006;332:299-310。
- PubMed ID
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16878701 (在PubMed］
- 摘要
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磷脂酶D (PLD)水解磷脂酰胆碱，产生膜相关的第二信使，磷脂酸(PA)和胆碱。两种磷脂酶D酶——PLD1和PLD2——已经被鉴定出来，尽管它们的调节机制尚未完全了解。为了研究PLD的调控，我们建立了一个重构系统，允许研究PLD酶在其原生环境中的作用，同时使细胞质被操纵。细胞被细菌溶菌素(链球菌溶菌素O)渗透，它在质膜上产生病变，导致胞质蛋白的释放。随着渗透次数的增加，鸟苷5'-[γ -硫]三磷酸和受体激活的PLD活性降低。一旦反应停止的条件建立，细胞因子，如胞浆和纯化的蛋白质，可以添加到这些细胞中以恢复活性。除了检测PLD活性外，该重构系统还允许研究PA的潜在细胞靶点，如通过监测PIP2合成的磷脂酰肌醇4-磷酸(PIP) 5激酶活性，以及功能输出，如胞吐。