核靶向和磷酸化所需要的泛素激活酶区域的鉴定。
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Stephen AG, Trausch-Azar JS, Handley-Gearhart PM, Ciechanover A, Schwartz AL
核靶向和磷酸化所需要的泛素激活酶区域的鉴定。
中华生物化学杂志，1997年4月18日;272(16):10895-903。
- PubMed ID
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9099746 (PubMed视图］
- 摘要
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泛素激活酶存在于两种亚型:E1a，主要定位于细胞核，和E1b，定位于细胞质。之前，我们生成了血凝素(HA)表位标记的cDNA构建物，HA1-E1(表位标记放置在第一个蛋氨酸之后)和HA2-E1(表位标记放置在第二个蛋氨酸之后)(Handley-Gearhart, p.m, Stephen, a.g .， Trausch-Azar, J. S.， Ciechanover, A.和Schwartz, a.l . (1994)Chem. 269, 33171-33178)，代表原生异构体。HA1-E1只存在于细胞核中，而HA2-E1主要存在于细胞质中。通过高分辨率等电聚焦和sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳，我们确认这些表位标记的结构体HA1-E1和HA2-E1代表E1a和E1b两种亚型。HA1-E1/E1a以一种非磷酸化形式和四种磷酸化形式存在，HA2-E1/E1b以一种主要的非磷酸化形式和两种少量磷酸化形式存在。我们证明了前11个氨基酸对于磷酸化和HA1-E1的专属核定位是必不可少的。在这个区域内有四个丝氨酸残基和一个假定的核定位序列(NLS;5 plskkrr)。去除这四种丝氨酸残基可使磷酸化水平降低60%，但对HA1-E1的核定位没有影响。 Each serine residue was independently mutated to an alanine and analyzed by two-dimensional electrophoresis; only serine 4 was phosphorylated. Disruption of the basic amino acids within the NLS resulted in loss of exclusive nuclear localization and a 90-95% decrease in the phosphorylation of HA1-E1. This putative NLS was able to confer nuclear import on a non-nuclear protein in digitonin-permeabilized cells in a temperature- and ATP-dependent manner. Thus the predominant requirement for efficient phosphorylation of HA1-E1/E1a is a functional NLS, suggesting that E1a may be phosphorylated within the nucleus.