拟南芥谷胱甘肽合成酶的反应机制:活性位点残基的定点诱变。
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李建军，李建军，李建军，李建军
拟南芥谷胱甘肽合成酶的反应机制:活性位点残基的定点诱变。
生物化学学报，2007;28(3):1757 - 1667。Epub 2007 4月22日。
- PubMed ID
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17452339 (PubMed视图］
- 摘要
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谷胱甘肽是维持细胞内氧化还原环境所必需的，由谷胱甘肽合成酶(GS)由γ -谷氨酰半胱氨酸、甘氨酸和ATP合成。为了研究真核生物GS的反应机制，对24个拟南芥GS (AtGS)突变体进行了动力学表征。在γ -谷氨酰半胱氨酸/谷胱甘肽结合位点，S153A和S155A突变体的动力学参数变化小于4倍，而结合位点远端的Glu-220 (E220A/E220Q)、Gln-226 (Q226A/Q226N)和Arg-274 (R274A/R274K)突变导致γ -谷氨酰半胱氨酸K(m)值增加24-180倍。与ATP相互作用的多个残基(K313M、K367M和E429A/E429Q)或与ATP配合的镁离子(E148A/E148Q、N150A/N150D和E371A)被取代，由于核苷酸结合受损，产生了非活性蛋白，这是通过荧光滴定测定的。ATP结合位点的其他突变(E371Q、N376A和K456M)导致ATP亲和力降低30倍以上，周转率降低80倍。位于两个底物结合位点界面的Arg-132和Arg-454突变对酶活性的影响不同。R132A突变体无活性，R132K突变体使k(cat)降低200倍;然而，两种突变体结合ATP的K(d)值与野生型酶相似。R454K突变体的动力学参数变化很小，但R454A突变体的k(cat)下降了160倍。此外，R132K、R454A和R454K突变将甘氨酸的K(m)值提高了11倍。 Comparison of the pH profiles and the solvent deuterium isotope effects of A. thaliana GS and the Arg-132 and Arg-454 mutants also suggest distinct mechanistic roles for these residues. Based on these results, a catalytic mechanism for the eukaryotic GS is proposed.