脲酶活性位点变异的动力学和结构表征。
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皮尔森马,公园,夏勒RA,米歇尔•罗Karplus PA, Hausinger RP
脲酶活性位点变异的动力学和结构表征。
生物化学。2000年7月25日,39 (29):8575 - 84。
- PubMed ID
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10913264 (在PubMed]
- 文摘
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克雷伯氏菌aerogenes脲酶使用双核的镍活性部位催化尿素水解> 10(14)倍自发率。为了更好地定义这种酶机制,我们检查了一套定点的动力学和结构变异涉及四个残留活性部位:His320, His219 Asp221, Arg336。野生型相比,脲酶、H320A H320N,和H320Q变异表现出类似的大约10(-)(5)倍不足率,适度的K (m)的变化,疾病的肽皮瓣覆盖其积极的网站。这些突变体酶异常的pH值资料6和肩膀延伸到附近的最适条件pH值9。H219A脲酶增加展品10(3)倍的K (m) /原生酶,而增加不明显(大约10(2)倍)在H219N H219Q变异保留氢键能力。这些变体结构显示清晰解决水分子活性位点被秩序井然的肽皮瓣覆盖。而D221N变体只是适度的影响与野生型酶相比,D221A脲酶具有较低的活动(大约10(-)(3)的原生酶),增加一个小K (m), pH值5最佳。D221A脲酶的晶体结构是让人想起His320变体。R336Q酶有大约10(-)(4)倍降低催化速率与pH值接近正常水平的依赖和K (m)的影响。Phenylglyoxal R336Q变体在超过一半的灭活率观察原生酶,证明修改non-active-site精氨酸可以消除活动,可能影响肽。 Our data favor a mechanism in which His219 helps to polarize the substrate carbonyl group, a metal-bound terminal hydroxide or bridging oxo-dianion attacks urea to form a tetrahedral intermediate, and protonation occurs via the general acid His320 with Asp221 and Arg336 orienting and influencing the acidity of this residue. Furthermore, we conclude that the simple bell-shaped pH dependence of k(cat) and k(cat)/K(m) for the native enzyme masks a more complex underlying pH dependence involving at least four pK(a)s.