功能的一个片段的表达人类dihydroorotate脱氢酶的杆状病毒表达载体系统,纯化重组酶的和动态的调查。
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Knecht W Bergjohann U, Gonski年代,Kirschbaum B, Loffler M
功能的一个片段的表达人类dihydroorotate脱氢酶的杆状病毒表达载体系统,纯化重组酶的和动态的调查。
8月15日。1996欧元;240 (1):292 - 301。
- PubMed ID
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8925840 (在PubMed]
- 文摘
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人类线粒体dihydroorotate脱氢酶(第四嘧啶从头合成的酶)被过度生产的重组杆状病毒中含有这种蛋白质的人类cDNA片段。后病毒感染和蛋白质表达Trichoplusia倪细胞(BTI-Tn-5B1-4)的亚细胞分布重组dihydroorotate脱氢酶是由两个截然不同的酶活性测定和免疫印迹分析反(dihydroorotate脱氢酶)搞笑。重组蛋白的靶向线粒体的昆虫细胞被证实。重组酶的活动在感染细胞的线粒体水平高出740倍的dihydroorotate脱氢酶在人类肝脏线粒体。在三步过程,dihydroorotate脱氢酶纯化特定活动大于50 U /毫克。凝胶排阻层析法显示42 kDa的分子质量和确认完全活跃的酶的存在作为一个单体的物种。荧光的辅因子分析显示在重组dihydroorotate FMN脱氢酶的存在。dihydroorotate值通过动力学分析,公里,ubiquinone-50被发现是4 microM microM和9.9,分别在公里值dihydroorotate和decylubiquinone microM microM 9.4和13.7,分别。应用表达系统将允许大量制备酶的结构和功能研究。纯化重组人类dihytdroorotate脱氢酶抑制剂检测其敏感性报道A77 1726 (2-hydroxyethyliden-cyanoacetic酸4-trifluoromethyl苯胺),这是异恶唑衍生物的活性代谢物leflunomide [5-methyl-N - (4-trifluoromethyl-phenyl) 4-isoxazole carboximide]。 An IC50 value of 1 microM was determined for A77 1726. Detailed kinetics experiments revealed uncompetitive inhibition with respect to dihydroorotate (Kiu = 0.94 microM) and non-competitive inhibition with respect to decylubiquinone (Kic = 1.09 microM, Kiu = 1.05 microM). These results suggest that the immunomodulating agent A77 1726 (currently in clinical phase III studies for the treatment of rheumatoid arthritis) is a very good inhibitor of human dihydroorotate dehydrogenase.