人85-kDa胞质磷脂酶A2活性位点亲核试剂的功能鉴定。
文章的细节
-
引用
复制到剪贴板 -
黄Z，帕耶特P，阿卜杜拉K，克伦丽什WA，肯尼迪BP
人85-kDa胞质磷脂酶A2活性位点亲核试剂的功能鉴定。
生物化学。1996年3月26日;35(12):3712-21。
- PubMed ID
-
8619991 (在PubMed］
- 摘要
-
Ser-228已被证明对人胞质磷脂酶A2 (cPLA2)的催化活性至关重要。然而，它在催化中的作用尚未被证实。通过位点定向诱变、活性位点定向不可逆抑制剂和新型荧光底物7-羟基香麻素酰基-亚麻酸盐，有证据表明Ser-228的羟基是cPLA2的催化亲核试剂。在与cPLA2突变体和环氧合酶-1共转染的COS-7细胞中，用Ala、Cys或Thr替换Ser-228导致这些突变体无法介导钙离子载体诱导的PGE2生成。从这些转染细胞的细胞裂解物中也没有检测到cPLA2磷脂水解酶活性水平，就像亲和柱纯化的S228A和S228C cPLA2突变体在昆虫细胞中过表达一样。活性的丧失不是由于突变酶无法转移到底物脂质界面，因为根据荧光能量转移判断，纯化的S228C cPLA2突变体与野生型一样，在钙存在的情况下转移到磷脂膜。然而，当活化底物7-羟基香豆素基-亚麻酸酯(其离去基pKa约为7.8)作为底物时，纯化的S228CC cPLA2突变体具有显著水平的7-羟基香豆素酯酶(7-HCEase)活性(约为野生型的1%)。S228A cPLA2突变体催化活性不高。与野生型cPLA2相反，硫代cPLA2的7-HCEase活性不是由不可逆活性位点定向抑制剂花生四烯基氟膦酸甲酯滴定的，而是由花生四烯基溴甲酮等量滴定的，花生四烯基结合位点定向巯基试剂。这些结果与Ser-228的羟基是cPLA2的催化亲核试剂，半胱氨酸可以取代丝氨酸作为亲核试剂，产生催化能力显著降低的cPLA2硫醇相一致。