85-kDa胞质磷脂酶A2催化功能必需残基的鉴定。探讨组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和精氨酸的作用。
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Pickard RT, Chiou XG, Strifler BA, DeFelippis MR, Hyslop PA, Tebbe AL, Yee YK, Reynolds LJ, Dennis EA, Kramer RM, Sharp JD
85-kDa胞质磷脂酶A2催化功能必需残基的鉴定。探讨组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和精氨酸的作用。
《生物化学杂志》1996年8月9日;271(32):19225-31。
- PubMed ID
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8702602 (PubMed视图］
- 摘要
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细胞质磷脂酶A2 (cPLA2)水解磷脂的sn-2-酰基酯键，并对含有花生四烯酸的底物表现出偏好。我们之前发现Ser-228对酶的活性至关重要，并可能在酶的催化中心发挥亲核试剂的作用(Sharp, j.d.， White, d.l.， Chiou, x.g.， Goodson, T.， Gamboa, g.c.， McClure, D.， burgtt, S.， Hoskins, J.， Skatrud, p.l.， Sportsman, j.r.， Becker, g.w.， Kang, l.h.， Roberts, e.f .和Kramer, r.m. (1991)化学，266,14850-14853)。cPLA2含有丝氨酸蛋白酶枯草菌素家族常见的催化天冬氨酸基序。在这个Ala基序中替换Asp-549完全灭活了酶，用谷氨酸或天冬酰胺替换分别使活性降低了2000倍和300倍。此外，利用半胱氨酸被丙氨酸取代的突变体，我们发现Cys-331是酶对n -乙基马来酰亚胺敏感的原因。令人惊讶的是，用丙氨酸替代19种组氨酸中的任何一种都不会产生无活性的酶，这表明经典的丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸机制在这种水解酶中不起作用。我们发现，用丙氨酸或组氨酸替代Arg-200确实会产生无活性的酶，而用赖氨酸替代则会使活性降低200倍。使用赖氨酸突变体(R200K)和香豆素酯底物获得的结果表明，Arg-200与磷脂底物的磷酸化基之间没有特异性相互作用。Arg-200, Ser-228和Asp-549在6个物种的cPLA2和4个非哺乳动物磷脂酶B中保守。 Our results, supported by circular dichroism, provide evidence that Asp-549 and Arg-200 are critical to the enzyme's function and suggest that the cPLA2 catalytic center is novel.